IPTG (आइसोप्रोपाइल-β-D-थियोगैलेक्टोसाइड) β-galactosidase सब्सट्रेट का एक एनालॉग है, जो अत्यधिक प्रेरक है।आईपीटीजी के प्रेरण के तहत, प्रेरक दमनकारी प्रोटीन के साथ एक कॉम्प्लेक्स बना सकता है, जिससे दमनकारी प्रोटीन की संरचना बदल जाती है, ताकि इसे लक्ष्य जीन के साथ जोड़ा न जा सके, और लक्ष्य जीन को कुशलतापूर्वक व्यक्त किया जा सके।तो प्रयोग के दौरान आईपीटीजी की सांद्रता कैसे निर्धारित की जानी चाहिए?क्या जितना बड़ा उतना अच्छा?
सबसे पहले, आइए IPTG प्रेरण के सिद्धांत को समझें: ई. कोली के लैक्टोज ऑपेरॉन (तत्व) में तीन संरचनात्मक जीन, Z,Y और A होते हैं, जो क्रमशः β-galactosidase, permease, और acetyltransferase को एन्कोड करते हैं।एलएसीजेड लैक्टोज को ग्लूकोज और गैलेक्टोज में या एलो-लैक्टोज में हाइड्रोलाइज करता है;लैसी पर्यावरण में लैक्टोज को कोशिका झिल्ली से गुजरने की अनुमति देता है और कोशिका में प्रवेश करता है;लैका एसिटाइल समूह को एसिटाइल-सीओए से β-गैलेक्टोसाइड में स्थानांतरित करता है, जिसमें विषाक्त प्रभाव को दूर करना शामिल है।इसके अलावा, एक ऑपरेटिंग अनुक्रम O, एक प्रारंभिक अनुक्रम P और एक नियामक जीन I है। I जीन कोड एक दमनकारी प्रोटीन है जो ऑपरेटर अनुक्रम की स्थिति O से बंध सकता है, ताकि ऑपेरॉन (मेटा) दमित हो और कामोत्तेजित।प्रारंभिक अनुक्रम पी के अपस्ट्रीम में कैटोबोलिक जीन एक्टिवेटर प्रोटीन-सीएपी बाइंडिंग साइट के लिए एक बाइंडिंग साइट भी है। पी अनुक्रम, ओ अनुक्रम और सीएपी बाइंडिंग साइट मिलकर लैक ऑपेरॉन के नियामक क्षेत्र का निर्माण करते हैं।जीन उत्पादों की समन्वित अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए तीन एंजाइमों के कोडिंग जीन को एक ही नियामक क्षेत्र द्वारा नियंत्रित किया जाता है।
लैक्टोज की अनुपस्थिति में, लैक ऑपेरॉन (मेटा) दमन की स्थिति में है।इस समय, पीआई प्रमोटर अनुक्रम के नियंत्रण में I अनुक्रम द्वारा व्यक्त लैक रिप्रेसर O अनुक्रम से बंध जाता है, जो आरएनए पोलीमरेज़ को P अनुक्रम से बंधने से रोकता है और प्रतिलेखन दीक्षा को रोकता है;जब लैक्टोज मौजूद होता है, तो लैक ऑपेरॉन (मेटा) को प्रेरित किया जा सकता है। इस ऑपेरॉन (मेटा) प्रणाली में, वास्तविक प्रेरक लैक्टोज ही नहीं है।लैक्टोज कोशिका में प्रवेश करता है और β-गैलेक्टोसिडेज़ द्वारा उत्प्रेरित होकर एलोलैक्टोज में परिवर्तित हो जाता है।उत्तरार्द्ध, एक प्रेरक अणु के रूप में, दमनकारी प्रोटीन से बंधता है और प्रोटीन संरचना को बदलता है, जिससे ओ अनुक्रम और प्रतिलेखन से दमनकारी प्रोटीन का पृथक्करण होता है।आइसोप्रोपाइलथियोगैलेक्टोसाइड (आईपीटीजी) का प्रभाव एलोलैक्टोज के समान ही होता है।यह एक बहुत शक्तिशाली प्रेरक है, जो बैक्टीरिया द्वारा चयापचय नहीं किया जाता है और बहुत स्थिर है, इसलिए इसका प्रयोगशालाओं में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।
IPTG की इष्टतम सांद्रता कैसे निर्धारित करें?उदाहरण के तौर पर ई. कोली को लें।
सकारात्मक पुनः संयोजक पीजीईएक्स (सीजीआरपी/एमएससीटी) युक्त ई. कोली बीएल21 आनुवंशिक रूप से इंजीनियर स्ट्रेन को 50μg·mL-1 एम्पियर वाले एलबी तरल माध्यम में टीका लगाया गया था, और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत किया गया था।उपरोक्त कल्चर को विस्तार कल्चर के लिए 1:100 के अनुपात में 50μg·mL-1 एम्प युक्त 50 एमएल ताजा एलबी तरल माध्यम की 10 बोतलों में टीका लगाया गया था, और जब ओडी 600 का मान 0.6 ~ 0.8 था, तो आईपीटीजी को अंतिम एकाग्रता में जोड़ा गया था।यह 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 है।एक ही तापमान और एक ही समय पर प्रेरण के बाद, इसमें से 1 एमएल जीवाणु समाधान लिया गया था, और जीवाणु कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया गया था और प्रोटीन अभिव्यक्ति पर विभिन्न आईपीटीजी सांद्रता के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एसडीएस-पेज के अधीन किया गया था, और फिर सबसे बड़ी प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ IPTG एकाग्रता का चयन करें।
प्रयोगों के बाद, यह पाया जाएगा कि IPTG की सांद्रता यथासंभव बड़ी नहीं है।ऐसा इसलिए है क्योंकि IPTG में बैक्टीरिया के प्रति एक निश्चित विषाक्तता होती है।सांद्रण की अधिकता भी कोशिका को नष्ट कर देगी;और आम तौर पर बोलते हुए, हम आशा करते हैं कि कोशिका में जितना अधिक घुलनशील प्रोटीन व्यक्त किया जाएगा, उतना बेहतर होगा, लेकिन कई मामलों में जब आईपीटीजी की सांद्रता बहुत अधिक होगी, तो बड़ी मात्रा में समावेशन बनेगा।शरीर, लेकिन घुलनशील प्रोटीन की मात्रा कम हो गई।इसलिए, सबसे उपयुक्त आईपीटीजी एकाग्रता अक्सर जितनी बड़ी नहीं होती, उतना बेहतर होती है, लेकिन एकाग्रता जितनी कम होती है।
आनुवंशिक रूप से इंजीनियर उपभेदों को शामिल करने और खेती करने का उद्देश्य लक्ष्य प्रोटीन की उपज बढ़ाना और लागत कम करना है।लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति न केवल तनाव के अपने कारकों और अभिव्यक्ति प्लास्मिड से प्रभावित होती है, बल्कि अन्य बाहरी स्थितियों, जैसे कि प्रेरक की एकाग्रता, प्रेरण तापमान और प्रेरण समय से भी प्रभावित होती है।इसलिए, सामान्य तौर पर, किसी अज्ञात प्रोटीन को व्यक्त और शुद्ध करने से पहले, उचित परिस्थितियों का चयन करने और सर्वोत्तम प्रयोगात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रेरण समय, तापमान और आईपीटीजी एकाग्रता का अध्ययन करना सबसे अच्छा है।
पोस्ट करने का समय: दिसंबर-31-2021