आईपीटीजी (आइसोप्रोपिल-β-D-थियोगैलेक्टोसाइड) β-गैलेक्टोसिडेज़ सबस्ट्रेट का एक एनालॉग है, जो अत्यधिक प्रेरित करने योग्य है। आईपीटीजी के प्रेरण के तहत, प्रेरक प्रोटीन दमनकारी प्रोटीन के साथ एक कॉम्प्लेक्स बना सकता है, जिससे दमनकारी प्रोटीन की संरचना बदल जाती है और वह लक्ष्य जीन के साथ जुड़ नहीं पाता, इस प्रकार लक्ष्य जीन प्रभावी ढंग से व्यक्त होता है। तो प्रयोग के दौरान आईपीटीजी की सांद्रता कैसे निर्धारित की जानी चाहिए? क्या जितनी अधिक सांद्रता होगी उतना बेहतर होगा?
सबसे पहले, आइए आईपीटीजी प्रेरण के सिद्धांत को समझते हैं: ई. कोलाई के लैक्टोज ऑपेरॉन (तत्व) में तीन संरचनात्मक जीन, Z, Y और A होते हैं, जो क्रमशः β-गैलेक्टोसिडेज़, परमीज़ और एसिटाइलट्रांसफरेज़ को एन्कोड करते हैं। lacZ लैक्टोज को ग्लूकोज और गैलेक्टोज में, या एलो-लैक्टोज में हाइड्रोलाइज़ करता है; lacY वातावरण में मौजूद लैक्टोज को कोशिका झिल्ली से गुजरने और कोशिका में प्रवेश करने देता है; lacA एसिटाइल-CoA से एसिटाइल समूह को β-गैलेक्टोसाइड में स्थानांतरित करता है, जिससे विषाक्त प्रभाव समाप्त हो जाता है। इसके अतिरिक्त, एक ऑपरेटिंग अनुक्रम O, एक प्रारंभिक अनुक्रम P और एक नियामक जीन I होता है। I जीन कोड एक रिप्रेसर प्रोटीन है जो ऑपरेटर अनुक्रम के O स्थान से जुड़ सकता है, जिससे ऑपेरॉन (मेटा) दमित होकर बंद हो जाता है। आरंभिक अनुक्रम P के ऊपर कैटाबोलिक जीन एक्टिवेटर प्रोटीन-CAP बाइंडिंग साइट भी मौजूद है। P अनुक्रम, O अनुक्रम और CAP बाइंडिंग साइट मिलकर लैक्टोज ऑपेरॉन के नियामक क्षेत्र का निर्माण करते हैं। तीनों एंजाइमों के कोडिंग जीन एक ही नियामक क्षेत्र द्वारा नियंत्रित होते हैं, जिससे जीन उत्पादों की समन्वित अभिव्यक्ति सुनिश्चित होती है।
लैक्टोज की अनुपस्थिति में, lac ऑपेरॉन (मेटा) दमन की अवस्था में होता है। इस समय, PI प्रमोटर अनुक्रम के नियंत्रण में I अनुक्रम द्वारा व्यक्त lac रिप्रेसर, O अनुक्रम से बंध जाता है, जो RNA पॉलीमरेज़ को P अनुक्रम से बंधने से रोकता है और प्रतिलेखन की शुरुआत को बाधित करता है; लैक्टोज की उपस्थिति में, lac ऑपेरॉन (मेटा) प्रेरित हो सकता है। इस ऑपेरॉन (मेटा) प्रणाली में, वास्तविक प्रेरक स्वयं लैक्टोज नहीं है। लैक्टोज कोशिका में प्रवेश करता है और β-गैलेक्टोसिडेज़ द्वारा उत्प्रेरित होकर एलोलैक्टोज में परिवर्तित हो जाता है। एलोलैक्टोज, एक प्रेरक अणु के रूप में, रिप्रेसर प्रोटीन से बंध जाता है और प्रोटीन की संरचना को बदल देता है, जिससे रिप्रेसर प्रोटीन O अनुक्रम से अलग हो जाता है और प्रतिलेखन शुरू हो जाता है। आइसोप्रोपिलथियोगैलेक्टोसाइड (IPTG) का प्रभाव एलोलैक्टोज के समान ही होता है। यह एक बहुत ही शक्तिशाली प्रेरक है, जो बैक्टीरिया द्वारा चयापचय नहीं किया जाता है और बहुत स्थिर होता है, इसलिए इसका व्यापक रूप से प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाता है।
आईपीटीजी की इष्टतम सांद्रता कैसे निर्धारित करें? ई. कोलाई को उदाहरण के तौर पर लें।
सकारात्मक रिकॉम्बिनेंट pGEX (CGRP/msCT) युक्त आनुवंशिक रूप से संशोधित E. coli BL21 स्ट्रेन को 50 μg·mL⁻¹ Amp युक्त LB तरल माध्यम में डाला गया और 37°C पर रात भर कल्चर किया गया। उपरोक्त कल्चर को 50 μg·mL⁻¹ Amp युक्त 50 mL ताजे LB तरल माध्यम की 10 बोतलों में 1:100 के अनुपात में विस्तार कल्चर के लिए डाला गया, और जब OD600 मान 0.6~0.8 था, तो IPTG को अंतिम सांद्रता तक मिलाया गया। यह सांद्रता 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 mmol·L⁻¹ थी। समान तापमान और समान समय पर प्रेरण के बाद, उसमें से 1 मिलीलीटर जीवाणु घोल लिया गया, और जीवाणु कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा एकत्रित किया गया और प्रोटीन अभिव्यक्ति पर विभिन्न आईपीटीजी सांद्रता के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एसडीएस-पीएजीई के अधीन किया गया, और फिर सबसे अधिक प्रोटीन अभिव्यक्ति वाली आईपीटीजी सांद्रता का चयन किया गया।
प्रयोगों के बाद यह पाया गया कि आईपीटीजी की सांद्रता जितनी होनी चाहिए उतनी नहीं है। इसका कारण यह है कि आईपीटीजी जीवाणुओं के लिए विषैली होती है। अधिक सांद्रता होने पर कोशिकाएँ मर जाती हैं; सामान्यतः, हम चाहते हैं कि कोशिका में घुलनशील प्रोटीन की मात्रा जितनी अधिक हो, उतना अच्छा है, लेकिन कई मामलों में आईपीटीजी की सांद्रता बहुत अधिक होने पर बड़ी मात्रा में अशुद्धियाँ बन जाती हैं, जबकि घुलनशील प्रोटीन की मात्रा कम हो जाती है। इसलिए, आईपीटीजी की सबसे उपयुक्त सांद्रता अक्सर जितनी अधिक हो, उतना अच्छा नहीं होता, बल्कि जितनी कम हो, उतना अच्छा होता है।
आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों के प्रेरण और संवर्धन का उद्देश्य लक्षित प्रोटीन की उपज बढ़ाना और लागत कम करना है। लक्षित जीन की अभिव्यक्ति न केवल उपभेद के अपने कारकों और अभिव्यक्ति प्लास्मिड से प्रभावित होती है, बल्कि अन्य बाहरी परिस्थितियों, जैसे कि प्रेरक की सांद्रता, प्रेरण तापमान और प्रेरण समय से भी प्रभावित होती है। इसलिए, सामान्यतः, किसी अज्ञात प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण से पहले, उपयुक्त परिस्थितियों का चयन करने और सर्वोत्तम प्रायोगिक परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रेरण समय, तापमान और आईपीटीजी सांद्रता का अध्ययन करना सर्वोत्तम होता है।
पोस्ट करने का समय: 31 दिसंबर 2021